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细胞或组织总蛋白提取与浓度测定（BCA法）

实验步骤

细胞或组织总蛋白提取与浓度测定

1 细胞总蛋白提取（冰上防止蛋白裂解）

1）吸去培养皿中的培养基，加入1 ml预冷PBS缓冲液洗3次。

2）加入适量含1×蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液（10 cm培养皿中一般加入500 μl,六孔板一般100微）。

3）冰上裂解15-30 min，将裂解后的细胞用细胞刮子刮下，吸入1.5ml离心管中。（这个裂解时间的长短有没有影响不清楚，本人之前刮细胞太慢，常常往后一个刮完后前面一个已经裂解了好久，可能都要一个小时了，应该问题不大）

4）在4℃条件下，12,000 rpm离心15 min，收集上清，即为细胞总蛋白。

2 小鼠组织总蛋白提取

1）取小鼠组织约50-200 mg，加入500 µl预冷的含1×蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液。

2）将小鼠组织剪碎，并用组织匀浆器匀浆。

3）冰上静置30 min。

4）在4℃条件下，12,000 rpm离心30 min。收集上清，即为组织总蛋白。

3 蛋白浓度测定（BCA法）

利用北京普利莱的BCA蛋白定量试剂盒（P1511）进行蛋白浓度测定，具体操作步骤如下：

1）将BCA蛋白定量试剂盒中的BCA Reagent和Cu Reagent按照50:1的比例配制成BCA工作液。

2）将4 mg/ml的BSA溶液倍比稀释，配置成浓度为4、2、1、0.5、0.25及0.125 mg/ml的BSA溶液作为蛋白标准品。

3）在96孔板中每孔加入100 µl BCA工作液，再加入5 µl蛋白样品或标准品，每个蛋白样品需设两个平行孔，充分混匀，注意尽量避免出现气泡，37℃孵育30 min。

以BCA溶液作为空白对照，使用酶标仪测定595nm处的吸光度值。通过酶标仪自带软件拟合曲线并计算每个样品的蛋白浓度。

RIPA裂解液(RIPA Lysis Buffer)是一种传统的细胞组织裂解液。RIPA的本意是Radio Immunoprecipitation Assay。根据其裂解液的强度大致可以分为强、中、弱三类。（感觉这个总结不错）弱的裂解液适合做co-ip，如果是胞浆蛋白，对裂解液强度要求不高，如果是膜蛋白，要强裂解液。加了SDS裂解能力就比较强。